Norma Legal Oficial del día 08 de agosto del año 1999 (08/08/1999)

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TEXTO DE LA PÁGINA 7

MORDAZA, MORDAZA 8 de agosto de 1999

NORMAS LEGALES

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seleccionados por el usuario y acreditados por el Ministerio de Pesqueria. 1.4 Analisis del ADN mediante la tecnica de PCR a) Preparacion de la muestra Realizar la extraccion de acidos nucleicos en amortiguador, proteinasa K y sarkocil, continuandose con la extraccion normal basada en fenol, cloroformo y etanol. Se recomienda el uso de un buffer de digestion. Cuando vaya a ser procesado el cefalotorax del langostino, se deposita en un tubo esteril de microcentrifuga (1.5), homogeneizandose con un pistilo en solucion amortiguadora tris-NaCL 1X o en un buffer de KCL 50 mM, tris-HCL 10 mM a pH 8.3, 0.1 mg/ml de gelatina, nonidet P 40 0.45%, Tween 20 0.45% y proteinasa K 80 microgramos por mililitro. El volumen de buffer de digestion dependera del tamano del langostino, recomendandose usar 75 microlitros para cefalotorax de postlarvas de aproximadamente 15 mm. de longitud total y un volumen de mas de 400 microlitros para juveniles de aproximadamente 50 mm. de longitud total. Despues de digerir la muestra, se calienta a 60 ºC durante una hora, y luego a 95 ºC por diez minutos. A continuacion, se centrifuga a 12 000 rpm durante dos minutos, transfiriendose el sobrenadante a un tubo MORDAZA, el cual sera conservado en hielo. Enseguida, se transfieren 50 microlitros del digerido y se diluyen con 150 microlitros de buffer TE (10 mM tris-HCL, pH 8,0; 0,1 mM EDTA), procediendose a continuacion a la extraccion de proteinas con 200 microlitros de fenol, alcohol isoamilico, cloroformo (PIC) (25:1:24). Despues de agitar la muestra por cinco segundos, el tubo de reaccion se incuba durante cinco minutos a temperatura ambiente, centrifugandose a 12 000 rpm por dos minutos. Al final, se formara una fase acuosa y una organica, la primera (fase superior), que contiene los acidos nucleicos, se transfiere a un tubo MORDAZA de 0,5 ml, teniendo precaucion de no tocar la interfase ni la fase inferior, a efecto de no contaminar la muestra. Para precipitar el ADN se agregan y mezclan 20 microgramos de glicogeno, medio volumen de acetato de amonio 7.5 M (85 microlitros) y tres volumenes de etanol absoluto, incubando a temperatura ambiental durante una hora. Cada muestra se centrifuga a 12 000 rpm durante cinco minutos, enjuagando enseguida con 200 microlitros de etanos al 70% y dejando secar por diez minutos, para disolver a continuacion en 30 microlitros de buffer TE. En el caso de no utilizarse esta MORDAZA solucion podra conservarse en refrigeracion hasta el momento de su uso. La concentracion de ADN se determina por los metodos de corrimiento electroforetico en geles de agarosa al 1% en buffer TDE, o bien por espectrofotometria, realizando las lecturas a 260 nm. b) Procesamiento de la muestra Se efectua en un volumen de reaccion de 10 microlitros, el cual contiene: KCL 5 mM, TRIS HCL 10 mM (pH 9) MgCL2 1.5 mM triton X-100 0.1%, 0.2 mM de cada dNTP, 15 pmol de cada primer (5' ATC TGA TGA GAC AGC CCA AG 3;5' GGG AAT GTT AAA TAT GTA TGC G 3'), aproximadamente 10 ng de templado o molde (ADN extraido del langostino con probable infeccion) y 1 ul de TAQ polimerasa. Sobre este volumen de reaccion se agregan 25 microlitros de aceite mineral y se procede a realizar la amplificacion por 30 ciclos. El paso de desnaturalizacion se realiza a 94 ºC durante 30 segundos; el de anillamiento a 55 ºC por 45 segundos y el de extension a 72 ºC durante 45 segundos. El producto amplificado se examina en un gel de agarosa al 1% en buffer TBE. El producto amplificado debe ubicarse en la posicion correspondiente a 365 bp, con respecto al marcador de peso molecular. Para el caso del virus causante de la enfermedad de la "Cabeza Amarilla" (YHV) mediante el uso de trancriptasa reversa se convierte el ARN en cADN, el cual puede ser trabajado con la metodologia ya descrita para ADN. 2. PROTOCOLO PARA EL MONITOREO DEL AMBIENTE ACUATICO Y DE LOS ORGANISMOS VECTORES 2.1 Zonas de muestreo Para la ejecucion del monitoreo en mencion se debera establecer puntos o estaciones de muestreo estrategicos en el ambito natural de la MORDAZA geografica en la cual se encuentran ubicadas las langostineras. Estas estaciones de muestreo estaran ubicadas en: - Principales esteros de donde se bombea agua a los estanques de las langostineras y/o adonde se evacuan luego de su uso. - Zonas en el mar cercanas a los desagues de las plantas de procesamiento de langostinos y otros productos hidrobiologicos. - Zonas costeras cercanas a las anteriormente mencionadas.

Estas estaciones de muestreo deberan ser establecidas en mayor numero en la MORDAZA colindante con Ecuador. Se recomienda que en las estaciones se midan algunos parametros como temperatura y salinidad, los cuales ayudaran en la interpretacion epidemiologica en posibles futuros casos de presencia de especimenes portadores de los virus materia de este protocolo. 2.2 Monitoreo del medio acuatico En las estaciones establecidas y en la MORDAZA subsuperficial se tomaran las muestras haciendo un MORDAZA en el agua usando redes con abertura de malla de 1mm. y de 300 micrometros. El material obtenido sera colocado en recipientes de tamano adecuado y fijado con alcohol etilico al 95% en una relacion 1:10, llevado al laboratorio para el analisis de los organismos presentes y posteriormente de los extractos de DNA mediante la tecnica de PCR. 2.3 Monitoreo de los organismos silvestres En las mismas estaciones se obtendra especimenes vivos de crustaceos de la fauna MORDAZA (langostinos, cangrejos reptantes y nadadores, jaibas, mysidaceos, etc.) para su analisis en laboratorio mediante la tecnica de PCR. a) Tamano de la muestra El tamano de la muestra debera dar una probabilidad del 95% de detectar a los portadores en la totalidad de la captura, asumiendo una prevalencia de portadores en la poblacion del 2% (ver tabla 3.1 a). b) Metodo de muestreo El muestreo sera aleatorio dentro de las estaciones establecidas. c) Preparacion y envio de la muestra Los extractos de ADN deberan ser obtenidos de muestras de hemolinfa, branquias o apendices, los cuales pueden provenir de especimenes individuales o de "pools" de varios individuos. Las muestras, tanto del medio acuatico como de los organismos silvestres, deberan ser remitidas inmediatamente a los laboratorios seleccionados por el usuario y acreditados por el Ministerio de Pesqueria. 2.4 Analisis mediante la tecnica de PCR El procedimiento para el analisis tanto del material obtenido del monitoreo del medio acuatico como del monitoreo de las especies silvestres, sera el mismo indicado en el punto 1.4 correspondiente al Protocolo de Muestreo para la Certificacion. Se recomienda que la cantidad de ADN a usar para el templado o molde sea 10 ng. 3. PROCESAMIENTO DE DATOS Y DESTINO DE LA INFORMACION SOBRE LOS MONITOREOS Los resultados obtenidos de los analisis, asi como los datos concernientes a las muestras procesadas, seran registrados en formatos ad hoc elaborados por el laboratorio autorizado. Para el caso de los monitoreos, la informacion que se obtenga debera ser periodicamente alcanzada a la Direccion Regional de Pesqueria de Tumbes, excepto cuando se detecte la presencia del virus de cualquiera de las enfermedades que son materia del mismo, en que se comunicara inmediatamente. 10159

RELACIONES EXTERIORES
Delegan facultades para suscribir Acuerdo de Alcance Parcial de Complementacion Economica con Ecuador, Colombia, Venezuela y la Republica Federativa del Brasil
RESOLUCION SUPREMA Nº 342-99-RE MORDAZA, 6 de agosto de 1999