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Pág. 176609 NORMAS LEGALES Lima, domingo 8 de agosto de 1999 seleccionados por el usuario y acreditados por el Ministerio de Pesquería. 1.4 Análisis del ADN mediante la técnica de PCR a) Preparación de la muestra Realizar la extracción de ácidos nucleicos en amortigua- dor, proteinasa K y sarkocil, continuándose con la extracción normal basada en fenol, cloroformo y etanol. Se recomienda el uso de un buffer de digestión. Cuando vaya a ser procesado el cefalotórax del langosti- no, se deposita en un tubo estéril de microcentrífuga (1.5), homogeneizándose con un pistilo en solución amortiguadora tris-NaCL 1X o en un buffer de KCL 50 mM, tris-HCL 10 mM a pH 8.3, 0.1 mg/ml de gelatina, nonidet P 40 0.45%, Tween 20 0.45% y proteinasa K 80 microgramos por mililitro. El volumen de buffer de digestión dependerá del tamaño del langostino, recomendándose usar 75 microlitros para cefalotórax de postlarvas de aproximadamente 15 mm. de longitud total y un volumen de más de 400 microlitros para juveniles de aproximadamente 50 mm. de longitud total. Después de digerir la muestra, se calienta a 60 ºC durante una hora, y luego a 95 ºC por diez minutos. A continuación, se centrifuga a 12 000 rpm durante dos minutos, transfiriéndose el sobrenadante a un tubo nuevo, el cual será conservado en hielo. Enseguida, se transfieren 50 microlitros del digerido y se diluyen con 150 microlitros de buffer TE (10 mM tris-HCL, pH 8,0; 0,1 mM EDTA), procediéndose a continuación a la extracción de proteínas con 200 microlitros de fenol, alcohol isoamílico, cloroformo (PIC) (25:1:24). Después de agitar la muestra por cinco segundos, el tubo de reacción se incuba durante cinco minutos a temperatura ambiente, centrifu- gándose a 12 000 rpm por dos minutos. Al final, se formará una fase acuosa y una orgánica, la primera (fase superior), que contiene los ácidos nucleicos, se transfiere a un tubo nuevo de 0,5 ml, teniendo precaución de no tocar la interfase ni la fase inferior, a efecto de no contaminar la muestra. Para precipitar el ADN se agregan y mezclan 20 micro- gramos de glicógeno, medio volumen de acetato de amonio 7.5 M (85 microlitros) y tres volúmenes de etanol absoluto, incubando a temperatura ambiental durante una hora. Cada muestra se centrifuga a 12 000 rpm durante cinco minutos, enjuagando enseguida con 200 microlitros de eta- nos al 70% y dejando secar por diez minutos, para disolver a continuación en 30 microlitros de buffer TE. En el caso de no utilizarse esta última solución podrá conservarse en refrige- ración hasta el momento de su uso. La concentración de ADN se determina por los métodos de corrimiento electroforético en geles de agarosa al 1% en buffer TDE, o bien por espectrofotometría, realizando las lecturas a 260 nm. b) Procesamiento de la muestra Se efectúa en un volumen de reacción de 10 microlitros, el cual contiene: KCL 5 mM, TRIS HCL 10 mM (pH 9) MgCL2 1.5 mM tritón X-100 0.1%, 0.2 mM de cada dNTP, 15 pmol de cada primer (5’ ATC TGA TGA GAC AGC CCA AG 3;5’ GGG AAT GTT AAA TAT GTA TGC G 3’), aproximadamente 10 ng de templado o molde (ADN extraído del langostino con probable infección) y 1 ul de TAQ polimerasa. Sobre este volumen de reacción se agregan 25 microlitros de aceite mineral y se procede a realizar la amplificación por 30 ciclos. El paso de desnaturalización se realiza a 94 ºC durante 30 segundos; el de anillamiento a 55 ºC por 45 segundos y el de extensión a 72 ºC durante 45 segundos. El producto amplificado se examina en un gel de agarosa al 1% en buffer TBE. El producto amplificado debe ubicarse en la posición correspondiente a 365 bp, con respecto al marcador de peso molecular. Para el caso del virus causante de la enfermedad de la "Cabeza Amarilla" (YHV) mediante el uso de trancriptasa reversa se convierte el ARN en cADN, el cual puede ser trabajado con la metodología ya descrita para ADN. 2. PROTOCOLO PARA EL MONITOREO DEL AM- BIENTE ACUATICO Y DE LOS ORGANISMOS VEC- TORES 2.1 Zonas de muestreo Para la ejecución del monitoreo en mención se deberá establecer puntos o estaciones de muestreo estratégicos en el ámbito natural de la zona geográfica en la cual se encuentran ubicadas las langostineras. Estas estaciones de muestreo estarán ubicadas en: - Principales esteros de donde se bombea agua a los estanques de las langostineras y/o adonde se evacuan luego de su uso. - Zonas en el mar cercanas a los desagües de las plantas de procesamiento de langostinos y otros productos hidrobiológicos. - Zonas costeras cercanas a las anteriormente mencionadas.Estas estaciones de muestreo deberán ser establecidas en mayor número en la zona colindante con Ecuador. Se recomienda que en las estaciones se midan algunos parámetros como temperatura y salinidad, los cuales ayuda- rán en la interpretación epidemiológica en posibles futuros casos de presencia de especímenes portadores de los virus materia de este protocolo. 2.2 Monitoreo del medio acuático En las estaciones establecidas y en la capa subsuperficial se tomarán las muestras haciendo un lance en el agua usando redes con abertura de malla de 1mm. y de 300 micrómetros. El material obtenido será colocado en recipientes de tamaño adecuado y fijado con alcohol etílico al 95% en una relación 1:10, llevado al laboratorio para el análisis de los organismos presentes y posteriormente de los extractos de DNA mediante la técnica de PCR. 2.3 Monitoreo de los organismos silvestres En las mismas estaciones se obtendrá especímenes vivos de crustáceos de la fauna silvestre (langostinos, cangrejos reptantes y nadadores, jaibas, mysidáceos, etc.) para su análisis en laboratorio mediante la técnica de PCR. a) Tamaño de la muestra El tamaño de la muestra deberá dar una probabilidad del 95% de detectar a los portadores en la totalidad de la captura, asumiendo una prevalencia de portadores en la población del 2% (ver tabla 3.1 a). b) Método de muestreo El muestreo será aleatorio dentro de las estaciones esta- blecidas. c) Preparación y envío de la muestra Los extractos de ADN deberán ser obtenidos de muestras de hemolinfa, branquias o apéndices, los cuales pueden provenir de especímenes individuales o de "pools" de varios individuos. Las muestras, tanto del medio acuático como de los organismos silvestres, deberán ser remitidas inmediata- mente a los laboratorios seleccionados por el usuario y acreditados por el Ministerio de Pesquería. 2.4 Análisis mediante la técnica de PCR El procedimiento para el análisis tanto del material obtenido del monitoreo del medio acuático como del monito- reo de las especies silvestres, será el mismo indicado en el punto 1.4 correspondiente al Protocolo de Muestreo para la Certificación. Se recomienda que la cantidad de ADN a usar para el templado o molde sea 10 ng. 3. PROCESAMIENTO DE DATOS Y DESTINO DE LA INFORMACION SOBRE LOS MONITOREOS Los resultados obtenidos de los análisis, así como los datos concernientes a las muestras procesadas, serán regis- trados en formatos ad hoc elaborados por el laboratorio autorizado. Para el caso de los monitoreos, la información que se obtenga deberá ser periódicamente alcanzada a la Dirección Regional de Pesquería de Tumbes, excepto cuando se detecte la presencia del virus de cualquiera de las enfermedades que son materia del mismo, en que se comunicará inmediata- mente. 10159 RELACIONES EXTERIORES Delegan facultades para suscribir Acuerdo de Alcance Parcial de Complementación Económica con Ecuador, Colombia, Venezuela y la Re- pública Federativa del Brasil RESOLUCION SUPREMA Nº 342-99-RE Lima, 6 de agosto de 1999